海产品沙门氏菌污染的监控与溯源技术研究

【摘要】沙门氏菌为一种重要的食源性致病菌，是造成许多国家发生食源性细菌性肠炎的主要原因之一。全球每年约有1600万由沙门氏菌所引起的感染病例，其中死亡病例60万。为保障人类食品卫生安全，减少因沙门氏菌污染带来的巨额经济损失，建立沙门氏菌快速检测方法及开展溯源性研究迫在眉睫。本研究通过开展海产品中沙门氏菌的荧光定量PCR快速检测、基于多位点序列分型方法的溯源性分析和沙门氏菌耐药性研究，为海产品中沙门氏菌的防控提供重要技术支撑，因而具有十分重要的社会和经济意义。本研究的主要内容与结果如下：1.海产品中沙门氏菌荧光定量PCR技术的建立及应用根据沙门氏菌属特异性基因Ompc设计1对引物和TaqMan探针，优化荧光定量PCR反应体系与反应条件，最终建立适合于海产品中沙门氏菌快速检测的荧光定量PCR方法。(1)特异性：用荧光定量PCR方法对实验中所用的32株菌株（包括肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特菌等）进行检测，其中沙门氏菌属菌株的检测结果均为阳性，而非沙门氏菌属菌株的检测结果均为阴性。表明本研究建立的荧光定量PCR方法具有高特异性。(2)灵敏性：将本研究制备的沙门氏菌Ompc阳性重组质粒以1：10倍比稀释，以此为模板进行荧光定量PCR扩增，检测结果表明该方法的检出下限为每μL1×101拷贝数，表明本研究建立的荧光定量PCR方法灵敏度高。对舟山水产品加工厂和舟山菜市场的120份样品采用荧光定量PCR方法和国标法进行检测，检测结果一致，均检出12株沙门氏菌，检出率为10.0%。利用建立的荧光定量PCR检测方法再对市场所售的新鲜猪肉200份进行检测，其中包括常温鲜猪肉50份，冷鲜猪肉150份。同时用国标法进行检测验证，其检测结果与荧光定量方法相一致。其中常温鲜猪肉中检出了4份，检出率为8%（4/50），冷鲜猪肉中检出了17份，检出率为11.3%(17/150)，总检出率为10.5%(21/200)。2.海产品中沙门氏菌的多位点序列分型技术的研究参照MLST网站中沙门氏菌属的基因数据库，选取了沙门氏菌7个看家基因aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA和thrA，对不同来源的海产品沙门氏菌分离株进行多位点序列分型，并使用DNAstar.Lasergene.v7.1软件对46株分离株进行分析，初步探明各菌株间的亲缘关系，并阐明舟山地区沙门氏菌流行序列型。结果表明46株沙门氏菌分离株共可分为20个序列型。其中优势序列型为ST11，共12株占总数的26.1%（12/46），其次为ST34，共5株占总数的10.9%（5/46），ST155共4株占总数的8.7%（4/46），序列型ST14和ST19，均为3株占总数的6.5%（3/46），序列型ST46、ST64、ST185和ST1500各2株，占总数的4.4%（2/46）。ST29、ST106、ST197、ST203、ST413、、ST1291、ST1542、ST1561、ST1808、ST1809和ST1810各1株，占2.2%（1/46）。新发现3个序列型分别是ST1808、ST1809和ST1810。3.海产品中沙门氏菌的耐药性研究采用Vitek2Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统对46株海产品沙门氏菌分离株耐药性进行检测，对常用的18类抗生素的耐药状况进行分析。药敏结果显示分离株具有较为严重的耐药及多重耐药现象，其中对头孢唑啉、头孢替坦、阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素的耐药率最高，为100.0%。其次为呋喃妥因（73.9%）、氨苄西林（39.1%）、氨苄西林/舒巴坦（39.1%），复方新诺明（17.4%），环丙沙星（4.3%），左旋氧氟沙星（2.2%），头孢他啶（2.2%）和头孢曲松（2.2%）。所有沙门氏菌分离株对厄他培南和亚胺培南药物均敏感。值得关注的是本研究检测到了氟喹诺酮和三代头孢的耐药菌株。在分离株的多重耐药中，6重耐药菌株所占比例最大，占34.4%(16/46)，其次为5重耐药菌株，占26.1%(12/46)。多重耐药率（同时对≥2种抗生素耐药）达到100%。这些结果表明应加强海产品中沙门氏菌的监控力度。
【作者】刘颖；
【导师】周向阳；江玲丽；
【作者基本信息】浙江海洋学院，食品加工与安全（专业学位），2014，硕士
【关键词】沙门氏菌；海产品；荧光定量PCR；MLST；耐药性；

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